机械-突破腺相关病毒载体包装容量限制的策略(二)

在rAAV 构成多聚体时重新组装 AAV 的基因组由两个病毒反向重复序列( ITR ) 和置于其间的rev、cap 基因组成, 在感染细胞后,AAV 之间通过ITR 相互连接构成多聚体。在rAAV 载体中, ITR 间的rev、cap 基因被基因治疗的目的基因所取代, rAAV 载体也仍然可以构成多聚体, 而且这类多聚体构成也是以附着体情势存在的目的基因长时间表达的机制之18 。 利用rAAV 载体构成多聚体这1特性, 可以有效地扩大rAAV 的包装容量。Duan 等9 将SV 40 和CMV 增强子置于1个rAAV 载体(AV. SupEnh) , 将其与仅含报告基因的rAAV 载体共转染细胞(AV. L uc) , 报告基因的表达水平是同时含相应调控元件与目的基因的rAAV 载体[AV. SV (P?SupEnh)L uc ]的10% , 如果在报告基因载体上加上1个异源启动子[SV 40,AV. SV (P)L uc , 则表达水平可上升到50%。将1样的载体转染C57BL 小鼠骨骼肌后, 报告基因的表达水平分别较仅转染AV. L uc 、AV. SV (P)L uc 载体者高600 倍和200 倍。该研究结果还提示ITR 可能有潜伏的启动子活性。虽然rAAV 载体已丧失了定点整合的能力, 但是仍可能有少量的载体基因整合到宿主基因组中去, 由于CMV 增强子和SV 40 增强子均没有组织特异性和启动子特异性, 而且ITR 序列所具有的潜伏启动子和增强子活性, 使其不能作为避免增强子作用分散的隔离子的作用, 所以当含这两种增强子的rAAV 载体与宿主基因组产生整合, 则可能导致邻近的基因活化, 如果所活化的基因是癌基因, 则有致癌的危险性, 因此需要对这类将调控元件与目的基因分别表达的策略做进1步的改进, 方能真正具有实用价值。选择基因组中所存在少量的启动子与组织特异性的增强子多是解决这1问题的途径之1, 这些增强子的作用可以被隔离子( Insulato r) 所阻断, 其仅在特异的蛋白因子的协助下, 作用于与之匹配的启动子, 促进基因表达10 。同时在rAAV 载体构建时, 在增强子与ITR 之间放置隔离子,这样恍如可以避免由于基因整合所带来的致癌危险。共转染的rAAV 载体间通过反式剪切重组出完全目的基因是利用rAAV 载体成多聚体这1特性扩大其包装容量的另外1策略。N akai H 等人11 在含无启动子的报告基因的rAAV 载体(AAV 2P less2nlsL acZ) 和含EF1a 启动子的rAAV 载体(AAV 2EF1aEP) 上分别加装1段保存有剪切位点的内含子序列, 将其同时经肝注射后, 在共同转染有这两种rAAV 载体肝细胞中, 构成多聚体的rAAV 载体串联构成完全的表达框架, 转录产物通过反式剪切将RNA 中的内含子及ITR 剪切去除, 从而获得了报告基因的正确表达, 但报告基因的表达水平仅为对照(同时含有调控元件与目的基因的rAAV 载体) 的2. 9%。但是当共转染有含两个头头相连(head2to2head) 的EF1a 启动子的rAAV 载体[AAV 2(EF1aEP) 2 后, 表达水平可以升高到对照的60%～ 70% , 其机制可能与这两个启动子在rAAV 载体构成多聚体后对其两侧所连接的目的基因转录启动和?或顺式增强作用有关。 基于类似的原理, Yang ZY 等12 将EPO 基因分成两个部分, 并分别在其尾端和头端附加上EPO 基因3 号内含子的部分序列及剪切位点后置于两个rAAV 载体中,以总共6×106 的剂量将两种载体肌肉注射的肾衰贫血模型中获得了治疗水平的EPO 表达。Chao H 13 等将因子DcDNA 表达盒分成两个部分, 1～ 12 号外显子与肝特异性启动子(L SP) 或CMV 启动子置于1个rAAV 载体, 而剩余的外显子与po lyA 置于另外1个rAAV 载体, 在两个载体的尾端和头端分别附加1段含剪切位点的内含子序列, 在共同转染细胞后可获得120mU?m l 的表达, 肝门注射小鼠后, 因子D 表达水平可到达正常2% , 延续时间4月。 上述策略虽然取得了1定的成绩, 但也存在明显的局限性。由于目的基因的表达框架分别置于两个载体中,单独的载体均不能有效表达, 而且反式剪切要求rAAV载体多聚体构成的进程中必须有正确的方向, 即头尾相连, 虽然在Chao H 的研究中认为头2尾相连是主要的多聚体构成方式, 但是在N akai H 等也提到了其他情势如头2头, 尾2尾集体土地建厂房违法吗, 尾2头等连接方式在体内也多是存在的。因此通过反式剪切扩大rAAV 载体包装容量的策略效率其实不是最理想。Duan D 等人14 利用反式剪切机理将B2gal 基因作为报告基因分别构建于不同的rAAV 载体中,在小鼠肌肉中仅获得了具有完全表达框架的rAAV 载体的4. 3%的表达水平, 也说明反式剪切的较低的表达效率是阻碍其利用的主要障碍。不同rAAV 载体间同源重组 具有相同DNA 序列的基因片断可能在细胞内产生同源重组而构成完全的基因, 而且同源序列间重组的效率在超过1定的长度以后, 与同源序列间堆叠长短无关。Halber C15等人将碱性磷酸酶基因(A P) 分成两个部分表达于rAAV 载体当中, 两个载体中的基因序列有440～1000 个碱基的堆叠, 共转染细胞后, 无同源序列的载体不产生A P, 而有同源序列的产生A P, 且产生的效率与剂量相干, 与同源序列的长短无关。此研究结果提示通过基因片断间的同源重组可能作为扩大rAAV 载体包装容量的途径之1。但相干研究提示, 在以B2gal 为报告基因时, 通过同源重组在细胞内表达的基因的水平仅为含完全表达框架的载体的0. 37%14 。因此, 可能同源重组仅在部分组织或针对部分基因有效。 综上所述, 通过对AAV 生物学特点及目的基因结构特点的认识, 及基因表达调控研究的深入, 采取恰当的策略扩大rAAV 载体的包装容量以扩大其利用范围已成为可能, 实验研究也已取得较大的进展, 但距临床利用还有不小的距离商业门面拆迁怎么赔偿拆迁, 还需进行大量的实验与临床研究以解决其中的困难。作者/上海第2医科大学瑞金医院上海血液学研究所武文漫　综述　王鸿利　沈志祥　审校